神經根慢性嵌壓損傷動物模型 

脊髓退行性病變等引起的神經根嵌壓傷，是一個慢性損傷過程。其主要表現為椎間盤突出、關節突增生、黃韌帶肥厚等，繼之造成神經根受壓，引起相應癥狀。因此，建立接近神經根在神經通道內受壓的動物模型，進行各項研究指標的觀測，有利于了解疾病的發生、發展及探索有效的臨床治療方法。現在已有大量動物模型用于研究神經根受壓后的變化，常用的造模動物有狗、豬、家兔、大鼠等，施加壓迫所用的材料亦各不相同。

1 自身骨性增生法(caused by self-bone hyperplasia)

(1)復制方法

1)手術操作  健康家貓，體重為3～5kg，雌雄不拘。經耳緣靜脈注射硫噴妥鈉(25mg/kg體重)麻醉后，俯臥位固定，剪除手術區域毛發，局部皮膚消毒，無菌操作。分別在下頸段和腰段做正中切口，顯露右側C7、C8、L5、L6神經根及椎間孔內口，用牙髓鉆破壞椎間孔周圍骨皮質后，將咬除的棘突剪成3mm×10mm的骨條，在中間處對折呈“V’形骨塊，從椎間孔內口向外，沿骨壁嵌于神經根通道的骨性管道內及側隱窩后方，左側做正常對照。術后給予抗感染治療3d(按每只2萬 U/d肌肉注射慶大霉素或按50mg/kg體重腹腔注射頭孢唑啉鈉)。觀察動物術后的一般情況、肢體運動和肌力狀態。

2)檢測內容與方法

①影像學和MEP檢測  在造模術前和術后的2, 4, 8, 12, 24周將實驗動物于麻醉下行X光平片和CT檢查，以確定手術處神經根通道的狹窄程度和神經根受壓狀態。同時進行MEP(磁刺激運動誘發電位檢測)檢測，刺激位點：脊髓點，C8～T1或L5～6棘突之間；周圍神經叢點為ErB'S點，在T1棘突與同側前肢遠端連線上，距T1棘突5cm處。接收電極置于相應靶肌肉肌腹表面，接地電極置于刺激點與接收點之間。

②病理組織學檢查  動物在做神經根病理取材時，需觀察神經根受壓狀態和椎間孔大體形態。用游標卡尺測量椎間孔截面積，并與對照側比較；HE染色在光鏡下觀察神經纖維軸突、髓鞘、神經膜細胞、神經膜等的改變程度；碳酸鋰－蘇木素髓鞘特殊染色觀察髓鞘情況；透射電鏡觀察神經纖維、髓鞘的超微結構變化。

(2)模型特點

1)行為學癥狀及影像學和MEP檢測  術后2～5d動物實驗側肢體跛行，肢、腕和膝、踝呈屆曲位，不能負重，被動牽拉出現痛苦狀掙扎。10d后癥狀可減輕或消失，于4～6周上述癥狀再現。8周時出現不同程度的肌萎縮，對刺痛的躲避反射減弱。至12周時，部分動物肢體遠端可出現潰瘍。 X光平片和CT檢查顯示，2周左右時，植入骨邊界清楚，神經根管明顯較對側狹窄。隨著時間的推移，植入骨塊周邊密度降低，邊界模糊，椎間孔周圍骨皮質密度增高，呈增生反應。植入骨周圍及椎間孔處有骨痂形成，神經根管狹窄。 MEP檢測顯示，隨著病情的進展，出現脊髓刺激點和ErB's點誘發電位潛伏期延長，波幅降低，波形分化不清和雙峰波等異常現象。

2)病理組織學檢查  ①HE染色顯示：隨著病程的進展，表現為神經束膜、內膜水腫，部分髓鞘發生腫脹和無髓纖維變形。神經外膜增厚，可發生節段性脫髓鞘改變。神經纖維軸突發生節段性增粗、斷裂，遠端發生勒瓦氏變性。隨后變性的神經纖維結構崩解、吸收、形成空洞，增生的結締組織使整個神經干纖維化。②髓鞘特殊染色顯示：隨著損傷程度的加重，染色由深藍變為淡黃色，髓鞘變薄，數量減少。③透射電鏡顯示：髓鞘結構變形，內層向軸突內突出。在受損髓鞘周圍，均可見增大的神經膜細胞核，線粒體、滑面內質網、粗面內質網和高爾基體等明顯增殖。

(3)比較醫學  該模型采用椎間孔內自體松質骨植入，操作簡單、費用低廉、重復性好、成功率高。利用自體骨的增生和炎性粘連反應在椎間孔內和側隱窩處嵌壓神經根，使損傷部位、形式和病理過程與臨床更為接近。同時，也避免了由于異物植入反應對實驗結果造成的混雜因素。該模型的病理表現是一個漸進的過程，由直接受壓處開始逐漸向遠端發展，并引發周圍神經的一系列改變，在同一神經干中可并存幾種不同程度的損傷形式。無髓的感覺神經纖維變性明顯早于有髓的運動神經纖維，這與臨床神經受壓先出現感覺障礙而后影響運動功能相吻合。其病理學的改變也顯示了神經在慢性損傷過程中各階段的病理特征，可為相關實驗提供較可靠的動物模型。

該方法還可適用于脊髓各段神經根造模，嵌壓范圍可按需把握。

2 腰骶神經壓迫法(nerve lumbar-sacrum oppression)

常用的造模動物有狗、豬、家兔、大鼠等，施加壓迫所用的材料亦各不相同。下面綜合介紹幾種對不同動物腰骶神經的慢性壓迫法。

(1)復制方法

1)狗  Delamarter等將粗2.8mm的尼龍電纜線套住狗的馬尾神經，使硬脊膜囊縮窄50％～75％，產生馬尾神經受壓的效果可持續壓迫數天～數個月。經檢查皮質誘發電位、微血管結構和組織病理學方面的改變，認為縮窄50％是關鍵，壓迫>50％時將出現神經功能障礙和組織學改變。 Yoshizawa暴露狗的第7腰神經根2.5～2.8cm，將長5mm、內徑3mm(比神經根直徑稍粗)的硅膠管縱行切開套在神經根上，用7～0的尼龍線捆扎套管。觀察放置套管后24h、14d、1個月、6個月和12個月神經根的組織形態學、電生理學及血－神經屏障的變化。

此模型的病理機制與臨床具有相似性，硅膠管輕微活動引起的刺激破壞了神經根血－神經屏障，加上硅膠管內圍繞神經根產生的增生瘢痕，共同導致了神經根內水腫，前者是產生功能障礙的主要原因。

2)豬  豬的脊髓終止于第2骶椎水平。骶1背根神經節一半位于神經根管內，另一半位于椎管內，馬尾神經和下位骶神經根的脈管結構與人相似。Cornefjord將原用于制作冠狀動脈慢性閉塞模型的Ameroid縮窄器套在豬的骶1神經根周圍和背根神經節的近端制作慢性壓迫模型。該縮窄器長5.5mm，外層為一剛性金屬殼，內層為吸水后可膨脹的酪蛋白衍生物。觀察不同內徑的縮窄器對神經根引起的解剖形態及神經生理學改變。認為3.5mm為適內徑，能逐漸縮小，3周后固定于3.0mm，可達到緩慢壓迫神經根的目的。但神經根所受的壓迫不是直接由縮窄器自身產生，而是因術中的積血在神經根周圍形成肉芽組織機化為瘢痕，瘢痕組織對神經根產生直接壓迫效應。

該模型的優點是能使壓迫漸進發生，具有重復性和可控性，可產生慢性不性神經根損傷。

3)兔  兔的脊髓圓錐位于L7～S1水平。Toh特制了長度為20mm的“H”型不銹鋼金屬夾，將頂部和底部的空缺用來放置S2和S3的棘突，橫形的中間部有一直徑為3mm的可調旋鈕，用來壓迫兔腰骶部馬尾區的硬膜囊和神經根。壓迫可分3級，通過X線攝片進行調整：1級，旋鈕插入椎管前后直徑的1/9；2級，插入2/9；3級，插入1/3。壓迫可在1個月內一次完成，也可在1個月與2個月后漸進增加壓迫級別完成。

該裝置為能通過腦脊液施加量化的神經壓迫技術。

4)大鼠  大鼠經濟、易于管理、腰骶叢和人相似，是除狗、豬、兔等大動物以外的較為合適的實驗用小動物。

大鼠的脊髓終止于L3～4水平。學者們采用不同的材料壓迫腰骶神經根，使之產生慢性壓迫癥狀。Kawakami將4根長0.3cm的4/0鉻制腸線放在實驗大鼠的腰4～6神經根周圍，另用2根腸線松散環扎固定，對照組大鼠用2根4/0的絲線松環扎固定模型，觀察神經根受激惹后不同時期(1, 2, 3, 4, 6, 8, 10和12周)的病理生理改變和行為變化。雖然鉻制腸線和絲線均可使粗髓纖維減少，出現相同組織學改變，但只有鉻制腸線組才出現痛覺過敏現象；周躍等改用骨蠟局部固定鉻制腸線，操作簡單、損傷小，具有壓迫止血作用，術后也出現了痛覺過敏表現；Yamaguchi將一厚0.3mm、面積為3.5mm2的約占椎管橫截面37％的聚硅酮薄片插入大鼠腰4椎管內，覆蓋硬脊膜管的背側，制作腰椎管狹窄的實驗模型。觀察馬尾神經慢性受壓24周后形態和行為方面的改變，發現軸突存在持續的退變和再生現象；Yabuki取大鼠尾端的自體髓核，將其移至背根神經節近端的L5神經根處。對照組取同體積的自體肌肉組織以同樣的方法移至神經根處，觀察大鼠背根神經節和后爪血流的變化。發現髓核移植組背根神經節內流體壓力增加，神經根和后爪的血流量減少，肌肉移植組未發生血流量變化。由于背根神經節內不存在血一神經屏障，因而認為其交感活性增強，出現異常興奮并通過軀體交感反射引起上述變化，是椎間盤突出引起根性疼痛發病的重要原因。

髓核自體移植可用于研究神經根受壓時的炎性損傷效應。

以上四種動物慢性壓迫模型尚存在下述缺點：①均須手術施行部分椎板切除，手術操作較復雜，局部創傷大，破壞周圍組織結構。②對神經根壓迫程度不易控制，難以量化。③與神經根在神經通道內的壓迫不相符，臨床上壓迫緩慢發生，神經根在神經通道內靠椎管內的韌帶固定，當其受到壓迫時，有的緩沖余地，程度和力量不斷變化。④存在機械、炎癥、流體力學等不同的混雜干擾因素。

(2)實驗觀察

1)組織形態學觀察

①光鏡觀察神經慢性壓迫的早期表現為：神經根的硬脊膜和蛛網膜變厚，神經內膜間隙明顯充血、水腫和出血，伴有部分神經細胞腫脹、壞死和脫髓鞘樣改變，而神經纖維尚未發生變性反應；壓迫4周后，充血、出血和水腫明顯減輕，而以神經纖維的脫髓鞘樣改變、纖維細胞增生為主，有明顯的炎癥反應，神經纖維發生明顯變性。主要表現為大直徑有髓纖維數量明顯減少，而小直徑無髓纖維數量相對增多，軸突的體積和髓鞘明顯萎縮，神經外膜和神經內膜纖維化樣改變，膠原纖維明顯增多。

②電鏡觀察顯示：髓鞘板層結構呈點狀松散，板層結構排列疏松、紊亂和腫脹并擠突，軸突呈不規則樣改變，軸漿內細胞器密集。血管通透性顯著增加，神經膜細胞分泌功能增強。神經細胞內線粒體明顯腫脹，嵴排列紊亂和消失，呈空泡樣改變。核周粗面內質網減少，胞核呈顆粒樣改變，溶酶體多見，游離核糖體增多。胞漿內含有較多的呈空泡樣改變的粗面內質網、滑面內質網和擴張的高爾基扁平囊泡。細胞核膜出現“裂隙”樣改變。

2)電生理學檢測  壓迫3個月后，復合動作電位的振幅明顯降低，與早期粗有髓纖維數量的減少相一致；12個月后，復合動作電位的振幅和感覺神經的傳導速度都明顯下降。復合動作電位可靈敏反映神經根變性時粗有髓神經纖維的減少情況，但只要還存在粗有髓神經纖維，神經傳導速度就不會下降；脊髓誘發電位(SEP)的潛伏期(N1和P1波)明顯延長。用鉻制腸線炎性損傷后1周時潛伏期無顯著變化，2～4周后SEP的潛伏期明顯縮短，8周后延長。將刺激電極放在脛后神經和正中神經處，參考電極放在耳和鼻處，記錄標準的經皮層誘發電位曲線N1-P1-N2，發現潛伏期明顯縮短，波寬顯著延長，此項檢查能在出現癥狀之前就檢測出神經系統的異常。

3)血液動力學觀測

①背根神經節和后爪血流量的研究：Yabuki使用雙通道激光多普勒流速計監測血流，將血流量穩定15min的恒定值作為基準，每隔5min記錄一次，持續3h。發現髓核移植組背根神經節和同側后爪的血流量明顯減少。

②血－神經屏障的研究：采用EBA與Gd-DTPA的混合劑作為示蹤劑，通過MRI影像與熒光顯微鏡觀察神經組織內的分布情況，在受壓超過1個月時神經根內可見明顯的 EBA外滲現象。用HRP作為示蹤劑，在電鏡下可見受壓時間>1個月的神經纖維內膜腔存在HRP外滲現象，毛細血管內皮細胞緊密連接被破壞，出現HRP產物的胞飲小泡。跨細胞運輸示蹤劑的異常現象表明血－神經屏障的破壞導致了神經根水腫的形成，但蛛網膜滲漏屏障未受到破壞。

4)生化檢測  采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定腦脊液中的蛋白標記物，包括總蛋白、神經絲蛋白輕鏈、S-100蛋白、神經特異性烯醇酶和神經膠質原纖維。在神經根壓迫后1周，腦脊液中神經絲蛋白和總蛋白的濃度明顯增高。腦脊液中的蛋白標記物能靈敏反映神經根受壓后軸突損傷在腦脊液中的生化改變，是有用的檢測手段。

5)分子生物學檢測

①炎性因子的基因表達：采用RT-PCR技術檢測炎性因子TNF，IL-1β，IL-6，IL-10的mRNA表達。可見壓迫術7d后IL-1β，IL-6mRNA明顯升高，術后14d TNF的基因表達顯著增高，術后1L-10表達持續升高，45d達高峰。認為IL-1β、TNF可導致神經纖維退變和脫髓鞘改變， IL-10與痛覺過敏的產生有關。

②神經元細胞凋亡：神經根受壓后由于瓦勒變性和逆行性退變，脊神經節內神經元的胞體可發生損傷反應，出現潰變、死亡。已證明神經損傷后神經元的死亡過程與程序性細胞死亡相同，脊髓運動神經元和背根神經節感覺神經元均可出現凋亡細胞。

③GAP-43表達的變化：生長相關蛋白(GAP-43)是一種膜磷脂蛋白，富含于再生過程中的神經元軸突與生長錐中，其消長的變化可作為判定周圍神經損傷程度及再生速度的一項客觀指標。周圍神經無論是擠壓還是切斷性損傷之后，神經元都能加速合成及轉運GAP-43，待神經合成后便開始向下調控。研究表明，坐骨神經壓榨傷后1～2周， GAP-43mRNA急劇升高，4周達高峰，7周恢復正常。

6)神經行為觀測

①運動功能的觀察：采用肉眼觀察動物步態的方法，按功能障礙的程度不同分級。壓迫術后動物出現不同程度的垂足現象；用活動平板踏車測試動物行走持續時間，觀察在以2.4圈/s轉動以及每30s增加一倍轉速的轉桿上，記錄動物摔落的時間。神經根受壓動物行走持續時間明顯下降。

②無害性熱刺激和機械疼痛刺激的定量測定：可采用50W熱輻射燈作為熱刺激源直接照射動物肢體，用秒表記錄肢體回縮反應的潛伏期；用具有不同折彎強度的von Frey單纖維絲(0.976～46.54gf，克力)刺激動物肢體，當某根單絲刺激肢體發生回縮反應時，該單絲的折彎強度即為機械刺激強度值。比較兩側肢體，當患側數值大于健側時，表示感覺減退。小于健側時，表示感覺過敏。動物壓迫術后出現熱覺過敏和機械覺減退的現象。