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熒光原位雜交步驟

發布時間:2015/5/11點擊次數:1172


熒光原位雜交(FISH)實驗步驟

儀器設備
    1、 醫用微波爐;
     2、 水浴鍋;
     3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡;
     4、 OLYMPUS DP11數字顯微照相機。

FISH試劑
    (1)1×PBS:由10×PBS溶液稀釋而成,儲存于4℃;
     (2)20×SSC(pH7.0);
     (3)2×SSC,由20×SSC溶液稀釋而成;
     (4)25mg/ml蛋白酶K消化液。
     (5)變性液(70%甲酰胺+2×SSC,pH7.0):4ml 20×SSC;8ml蒸餾水;28ml甲酰胺。每次新鮮配制。
     (6)雜交后洗滌液: 20×SSC 4ml;蒸餾水16ml;甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調節pH前升至室溫。

實驗步驟
    1、脫蠟:
     1)二甲苯脫蠟3次,每次5min;
     2)100%酒精兩次,每次2min;
     3)移出酒精,斜置切片,標記末段向下,空氣干燥。
    2、蛋白酶處理:
     1)每個染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中預熱。將消化酶液加入管內,搖動直到酶溶解。
     2) 37℃水浴槽中預熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
     3) ×SSC在室溫下漂洗切片3次,每次1min。
     4)梯度酒精脫水(-20℃預冷)。
    3、變性:
     1)每一個立式染色缸配制40ml變性溶液;
     2)78℃水浴槽中平衡預熱混合液染色缸;
     3)78℃孵育8min;
     4) 即移入-20℃預冷70%酒精的染色缸內2min,再依次移入80%、90%和的-20℃預冷酒精內,每缸2min;
     5)空氣干燥。
    4、雜交:
     1)準備探針;
     2)取一個較大的濕盒,交叉放置切片;
     3)滴10μl探針在切片的組織上,加蓋玻片;
     4)蓋上濕盒蓋,37℃孵育12h~16h。
     雜交后的水洗:
     5)鑷子小心去除蓋玻片;
     6)43℃預熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
     7)2×SSC(37℃)洗兩次,每次10min;
     8)切片放人染色缸的1×PBS內待檢測,勿使切片干燥。
     檢測:
     9)從1×PBS中取出切片,除去過多的水分,避免標本干燥。把切片放入濕盒內,同時處理4張切片。
    
     11)去掉塑料蓋膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
擴增:
     12)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
     13)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
     14)去掉塑料蓋膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次,每次2min;
     15)從1×PBS中取出切片,斜置切片使液體排出;
     16)每張切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗體,加塑料蓋膜,室溫孵育20min;
     17)1×PBS室溫下洗3次,每次2min。
    5、細胞核染色:
     1)張切片加10μl~20μl DAPI,覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2~5ml;
     2)盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內可以在顯微鏡下觀察。

PRINS步驟
    1、常規脫蠟浸入0.01mol/LPBS;
    2、用0.2mol/L鹽酸處理5min;
    3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min;
    4、分別用80%,95%和100%酒精脫水,室溫干片;
    5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,各加200μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl,引物250ng,Taq DNA聚合酶2U),加蓋片;
    6、94℃變性5min后置入65℃濕盒中5min;
    7、用0.1×SSC液,65℃洗5min;
    8、片于65℃ 10s~20s;用4×SSC-0.1%吐溫20液42℃洗5min,2次;
    9、經Buffer I液洗后滴加20%羊血清封閉30min;
    
    11、BufferⅢ液洗5min;
    12、用BCIP-NBT顯色1h~2h,在鏡下控制,終止顯色;
    13、用中性紅或核固紅襯染,酒精脫水,二甲苯透明,樹脂封片。


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