腦缺血的觀察及腦缺血模型的評價方法

缺血性腦血管疾病是一個復雜的病理生理過程，評價腦缺血的指標各種各樣，研究中選取何種指標評價腦缺血的程度及藥物的療效尤為重要，現將主要的參考觀察指標綜述如下。

1.神經癥狀及體征的評價

腦損傷后出現相應的癥狀與體征，癥狀與體征的檢測又可以反映腦損傷與恢復的程度。常見的分級方法有：Bederson三級法、改良的Bederson、Zealonga 5分制評分法、 Tatlisumak 6分制評分法等。

常用的Bederson按受損程度分級，正常(0級)：①未見活動異常，大鼠被提尾懸空時兩前肢向地面伸直。②置動物于軟塑料板上，輕握鼠尾，在鼠肩后施加側向推力使鼠滑動約10cm，手感左右推動阻力相等；中度(1級)：①大鼠被提尾懸空時，腦缺血對側前肢呈屈曲、抬高、肩內收、肘關節(jié)伸直等。②基本同0級；重度(2級)：①同1級。②檢查方法同上，但缺血半球對側的側向推動阻力明顯降低。

Zealonga的5分制評分標準為：0分，無神經損害的癥狀；1分，不能伸展對側前爪；2分，向外側轉圈；3分，向對側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

癥狀與體征的檢測方法直接、簡便，從整體上反映損傷程度，不需要特殊儀器，但人為心理因素比較多，只需隨機測定，可靠程度低，可以用做初步篩選或輔助性指標。

2.定位記憶能力的評價

記憶是復雜的生理過程，在多重記憶系統(tǒng)中不同記憶系統(tǒng)有著不同的功能定位、神經環(huán)路、遞質系統(tǒng)和分子生物學機制。鼠腦缺血后伴有不同程度記憶力與空間定位的障礙，檢測的方法可采用：跳臺實驗、避暗實驗、定向游泳實驗、 Morris水迷宮實驗等。

3.腦電圖(EEC)

EEC提供了一種非創(chuàng)傷性研究腦的電活動，可以反映阻斷動脈的缺血區(qū)與非缺血區(qū)以及對側相應部位的腦電變化，通過生物電的角度從整體上分析腦損害與腦電圖的關系。在大鼠冠狀縫前相當于皮質感覺運動區(qū)(額頂區(qū))部位和頂葉后部(頂枕區(qū))的左右兩側對稱地分別放置腦電極各一個，電極穿過顱骨接觸硬腦膜，用牙科黏合劑固定，參考電極安置在鼻骨正中。八道生理記錄儀記錄。若應用腦電圖儀，可放置更多的電極，更能準確地反映腦缺血的范圍及其程度。缺血區(qū)腦電圖出現波幅降低，頻率減慢。

EEC檢測雖然易受外界條件的干擾，但它敏感、價廉、創(chuàng)傷少，故仍不失為一種比較好的檢測方法。

4.腦梗死面積及含水量測定法

(1)梗死面積測定  實驗證明大鼠動脈阻塞后3～4h梗死就可以達到大范圍，測定腦梗死的面積，應在術后4h以后進行。做腦切片，采用TTC(氯化三苯基四氮唑)染色顯示梗死的腦組織(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色為梗死區(qū))。梗死腦組織的測定方法可有：①應用透明紙描敘出每個切面兩面的外輪廓及梗死區(qū)。②應用坐標法、落點求積法等測量每片梗死區(qū)截面積和全腦截面積，計算梗死面積百分比。③可采用數碼相機拍照，輸入計算機，用圖像處理軟件計算梗死面積。④梗死范圍法：染色后，將白色腦組織挖下稱重，以梗死組織的質量占總腦質量百分比作為腦梗死范圍。

本方法客觀簡便，但是敏感度不高，肉眼觀察值誤差比較大，梗死區(qū)域的界限難以地確定。

(2)腦含水量測定  腦水腫是腦缺血不可避免的后果，早期腦水腫的減輕與控制可明顯地降低死亡率與致殘率，因此腦水腫的機制在不同缺血模型中被廣泛地檢測與研究。檢測的方法有：①直接法：斷頭取腦，分別稱量左右腦片濕重，烘烤至恒重，按腦水腫公式計算。②間接法：采用光鏡與電鏡觀測腦水腫組織、細胞與正常的腦組織、細胞的差別，以反映腦水腫的程度。

公式1  含水量＝[(濕重－千重)/濕重]×100％

公式2  含水量的變化＝[(右腦含水量－左腦含水量)/左腦含水量]×100％

本測定方法操作簡單，能夠客觀地反映腦水腫的程度，與面積法相互結合使用更佳。

5.軟腦膜微循環(huán)觀察

此法可以直接觀察軟腦膜微循環(huán)血液的灌流狀況，結合的微循環(huán)圖像處理系統(tǒng)可直接測量微血管的管徑及血流速度。方法為在大鼠顳頂部制作顱窗(顱窗的大小因動物種類不同而不同：犬10mm×15mm，家兔6mm×10mm，大鼠4mm×8mm)，用骨蠟及電熱燒灼器止血，無菌生理鹽水沖洗，待無出血點后，剪開硬腦膜，暴露軟腦膜。窗口用制備成顱窗大小及形狀的玻片覆蓋，牙科水泥封閉周圍間隙，待變硬后用手術刀將多余的部分切去。若顱窗周圍無滲出、窗內無氣泡與出血、腦血管無異常，表示顱窗制作成功。將實驗動物置于微循環(huán)儀下，可觀測到清晰的軟腦膜微血管圖像，通過攝像、錄像或照片記錄實驗結果，亦可用計算機微循環(huán)圖像處理系統(tǒng)，準確地測量微循環(huán)的各項指標。還可應用激光多普勒微循環(huán)血流分析儀，將激光探頭固定于顱窗上，只要激光探頭在整個實驗過程中無位置移動及轉動，即可準確的測定該部位的微循環(huán)血流量。

6.微透析結合液相色譜

微透析(microdialysis)是一種自生物活體內進行動態(tài)微量生化取樣的新技術。但由于微透析樣品體積小，難以進行前處理濃集，而各種生化物質的含量又很低，因而給樣品測定帶來了困難。目前由于毛細管電泳儀技術的提高，能夠檢測采集的樣品，使微透析技術日臻完善。應用微透析儀的方法為：在活體狀態(tài)下，將動物置于立體定向儀上，在前囟右側前、側各1.5mm插入微透析探針，深度3.5mm(或感興趣局域)。用灌流液灌流，速度2μl/min，基礎灌流60min后收集微透析液。與液相色譜或毛細血管電泳儀連用，動態(tài)觀測腦組織神經遞質、神經內分泌激素等活性物質的動態(tài)變化。

7.電化學方法

可采用對pH、離子以及其他物質敏感的電化學電極，利用立體定位儀直接放置在感興趣區(qū)域，動態(tài)觀測上述各指標的變化。如采用一氧化氮敏感電極結合電化學檢測技術，觀察電針對MCAO大鼠缺血側紋狀體一氧化氮釋放的影響等。

8.腦毛細血管通透性

大鼠按50mg/kg體重的劑量靜脈注射1％伊文斯藍，之后結扎大鼠雙側CCA。結扎后3h，斷頭取腦。將腦放入盛有5ml的甲酸胺溶液試管中浸泡，并置于45℃恒溫箱中溫

育72h。取出后用721分光光度計于620μm進行浸出液比色，測定光密度值。再以標準曲線查出5ml甲酸胺液中伊文斯藍含量，繼而計算出單位腦重的伊文斯藍含量。以此評價毛細血管通透性。

9.血管活性物質及其他生物活性物質的測定

在腦缺血的情況下，線粒體氧化代謝障礙，不能提供足夠的電子，且抗氧化系統(tǒng)被抑制，使含有不配對電子的自由基大量產生，超過機體的清除能力而造成損傷。因此測定脂質過氧化物(LOP)可以直接反映損傷的變化，測定氧自由基的清除劑超氧化物歧化酶(SOD)以及氧自由基攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸形成的脂質過氧化物丙二醛(MDA)能間接反映出細胞的損傷程度。可以通過化學發(fā)光法、自氧化法、熒光法、TBA比色法等進行測定。

氧自由基在各種損傷、應激、感染中都可以出現變化，故缺乏檢測的特異性和針對性，但它是機體反應的一種敏感指標，故可以作為急性期的輔助指標。

10.形態(tài)學指標法

(1)石蠟切片  HE染色觀察：主要用于顯示各種組織正常成分和病變的一般形態(tài)結構，進行的觀察。普通的 HE染色光鏡下就可以觀測到梗死區(qū)間質內大小不等的空泡、血管擴張、腦組織水腫，部分神經細胞核固縮、深染，部分神經細胞溶解、胞漿疏松、細胞界限不清，壞死區(qū)周邊可見嗜中性粒細胞。電鏡分辨率比較高，可觀察腦神經細胞缺血后的微血管狀態(tài)、膠質細胞形態(tài)、神經細胞的形態(tài)、線粒體的變化等。還可以應用示蹤技術進行定位。

(2)免疫組化法  應用標記的抗體對細胞或組織內相應的抗原進行定位、定性或定量檢測。經組化顯色后，用顯微鏡、熒光、電子顯微鏡觀察。凡是能作為抗原、半抗原的物質如C-jun蛋白表達、cycline-D蛋白表達、MAP-2等腦缺血損傷相關蛋白均可以應用免疫組化準確定位。根據標記物的性質，可將免疫組化染色法分為：①免疫熒光法；②免疫酶法。③免疫金銀法。④ABC法等。根據染色及抗體滴加步驟，分為直接法、間接法、橋法等。其結果除了在光鏡下觀察外，也可以輸入醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行圖像處理，檢測陽性細胞的平均灰度值。

免疫組化法在細胞、染色體或亞細胞水平原位檢測抗原分子，是其他生物技術難以達到和代替的。缺點是易于產生假陽性與假陰性，對于標本固定、選擇、干燥、儲存要求比較高。